Primo tentativo agar agar, consigli.

[Jnani]

Mi ha talmente affascinato qs mondo da incominciare a sperimentare un po’ di tutto. Soddisfatto dei miei risultati con PF Tek ho voluto avanzare e sperimentare ulteriori tecniche.
Una settimana fa ho voluto isolare su agar agar le impronte sporali liquide da me ricavate poiché ho visto son molto più produttive delle siringhe sporali acquistate on line. Così decido di seguire passo passo la wiki e preparo 15 piastre (5 vetro e 10 plastica). Procedo il più cautamente possibile preparando agar agar con soli 3 gr anziché 5 gr in quanto avrei usato siringa sporale e in quel caso aver dovuto tenerla più “morbida” (così ho capito). Non dispongo di cappa e pertanto lavoro solo in SAB. Impilo il tutto in SAB x una notte e sigillo con pellicola trasparente e lascio raffreddare.
Il giorno seguente in attesa del parafilm, inoculo cmq 5 piastre (3 vetro e 2 di plastica) con qualche goccia e senza toccare la superficie, mentre tutte le altre le lascio vergini in attesa di transfer. Le suddivido in diverse buste con chiusura ermetica e contenitori in pp (3 x la precisione) in attesa di sigillarle per bene.
Il giorno stesso alla sera, ripeto operazione in SAB di sigillo con parafilm e ripongo il tutto dove precedentemente lasciato.
Purtroppo dopo 3 gg torno a guardare e trovo il disastro. Le piastre “vergini” son tutte contaminate da differenti batteri. Ho trovato i più disparati colori, quindi le piastre di plastica le getto subito senza aprirle (8 pz) mentre quelle di vetro mi metto all’esterno e le pulisco da quel poco di batterio estraneo che si era creato sul bordo e le risciacquo in attesa di lavarle per bene e sterilizzarle di nuovo in forno e poi con vapore insieme a nuovo agar agar.
Durante la rimozione, ho notato che agar agar era molto morbido (da alcuni video notavo una consistenza molto maggiore) e sto riflettendo su che errori potrei aver commesso.
A distanza di una settimana mi son rimaste solo 3 piastre inoculate con spore liquide (2 vetro e 1 di plastica) e nessuna “vergine”.
Di queste 3 inoculate (presentano tutte uno strano “micelio”). In quelle di vetro vedo la scia bianca della siringa mentre in quella di plastica, un reticolo bianco particolare (però potrebbe sembrare micelio ai primordi ma diffuso su tutta la piastra (strano?) tipo come crepe bianche su agar agar.
Appena avrò modo pubblicherò qualche foto se é il caso.
Chiedo: secondo voi ho fatto un errore di processo per averne così tante contaminate? Se si dove? Pellicola in primis? Pessima tenuta? Pessima sterilizzazione delle piastre di plastica? (però anche quelle in vetro han avuto problemi pur essendo ben sterilizzate). Potrebbe essere che agar agar era troppo morbido e ci sta mettendo così tanto ad attechire? Solitamente quanto tempo impiega il micelio a formarsi considerando nell’ambiente in cui si trovano stivate le piastre si sta circa attorno ai 28 gradi? Dopo una settimana mi aspettavo di veder maggior riscontro. Su PF tek in una settimana con qs temperature (dai 28 fino ai 31 arrivo) le stesse spore, vedo quasi il vasetto full.
Pensavo di riprovare a breve, rifacendo il tutto con agar agar a 5gr (come da ricetta) quindi tenerlo più solido e migliorare il processo utilizzando solo piastre di vetro e alcune di plastica solo x prova rimaste inutilizzate dalla volta scorsa e tenendole ben separate da quelle di vetro. Utilizzerò subito il parafilm (avendolo gia). É forse meglio tenga le vergini con agar agar in frigo?
Le pietre di plastica le avevo “sterilizzate” in soluzione diluita con amuchina poi pulite con alcool isopropilico al 70 e lasciate asciugare in SAB. Ad oggi solo una si é “salvata”. Sterilizzazione troppa precaria. Opterò per solo quelle in vetro.
Stessi processi e stessa siringa sporale con PF tek non ho problemi.
Grazie.

[asklepios]

Quelle di plastica ha senso comprarle già sterili, altrimenti se le devi sterilizzare tu ti conviene usare il vetro. Sulla consistenza dell'agar è difficile dire, anche perché (senza contare la variabilità intrinseca della polvere) non hai indicato la concentrazione che hai preparato. 5 grammi su che volume di acqua? Detto questo, due cose da dire sulla consistenza dell'agar: ho notato che se non lo sciogli e mescoli bene prima di sterilizzarlo, a volte capita che sia più concentrato sul fondo della bottiglia e quindi il primo che versi rimanga molto liquido. Sulla consistenza, quella per germinare le spore è molto morbida, ma non abbastanza da essere liquido, deve mantenere una certa consistenza. Se vedi che è troppo molle aggiusta le dosi come hai fatto. La contaminazione può essere dovuto alle piastre, ma più probabilmente anche a un problema di tecnica, è normale all'inizio. Basta passare con la mano sopra la piastra aperta, un soffio d'aria nella stanza o un movimento brusco all'interno della SAB (correnti d'aria) per contaminare una piastra. Vedrai che con un po' di pratica risolverai abbastanza facilmente

[Jnani]

Quelle di plastica ha senso comprarle già sterili, altrimenti se le devi sterilizzare tu ti conviene usare il vetro. Sulla consistenza dell'agar è difficile dire, anche perché (senza contare la variabilità intrinseca della polvere) non hai indicato la concentrazione che hai preparato. 5 grammi su che volume di acqua? Detto questo, due cose da dire sulla consistenza dell'agar: ho notato che se non lo sciogli e mescoli bene prima di sterilizzarlo, a volte capita che sia più concentrato sul fondo della bottiglia e quindi il primo che versi rimanga molto liquido. Sulla consistenza, quella per germinare le spore è molto morbida, ma non abbastanza da essere liquido, deve mantenere una certa consistenza. Se vedi che è troppo molle aggiusta le dosi come hai fatto. La contaminazione può essere dovuto alle piastre, ma più probabilmente anche a un problema di tecnica, è normale all'inizio. Basta passare con la mano sopra la piastra aperta, un soffio d'aria nella stanza o un movimento brusco all'interno della SAB (correnti d'aria) per contaminare una piastra. Vedrai che con un po' di pratica risolverai abbastanza facilmente

Ciao @asklepios grazie, ci speravo in una tua risposta
Dunque, per quanto riguarda agar agar ho utilizzato 3gr (anziché 5gr) su 250ml di brodo + 5gr di glucosio (come da ricetta su wiki).
Ho tenuto un valore più basso di agar agar per tenerlo più morbido in quanto avrei colonizzato con siringa di spore (cosi ho inteso).
Era morbido ma troppo a mio avviso. Non rimaneva per niente compatto (solo leggermente gelatinoso quando l'ho rimosso da quelle in vetro contaminate, per recuperarle).

Ieri ho proceduto di nuovo con SOLO piastre di vetro, sterilizzate prima in forno. Per l'agar agar invece l'ho prima "cucinato" a microonde fino ad ottenere una soluzione omogenea, priva di grumi e sedimenti poi sterilizzato in pentola a pressione.
Uso una bottiglietta graduata in borosilicato con tappo a vite di quelle da laboratorio.
Sicuramente ho migliorato la procedura (tecnica) poiché ho trovato un video che mi ha illuminato e mostrato come versare senza passare sopra o rischiare di farlo (se volete posso pubblicare il link).
Son più positivo sulla riuscita questa volta. A breve colonizzerò nuovamente con la siringa sporale e sigillerò con parafilm tutto.

Per le piastre di plastica che avevo utilizzato (sarebbero dovute esser sterili) ma essendo i feedbacks contrastanti ho voluto comunque metterci del mio, disinfettando con soluzione diluita di amuchina ma temo di aver toppato molto facilmente. Lo dico giusto per chi volesse cimentarsi e abbia anche questo esperienza a disposizione.

Grazie per l'incoraggiamento. Son un testone e prima o poi ci riuscirò.

ps
le tre piastre "sopravvissute" al primo tentativo son ancora li ma troppo lente nella colonizzazione a mio avviso per aver successo, in ogni caso le tengo monitorate comunque. Una ha un aspetto alieno, poiché tenendole a testa in giù ha formato una specie di bolla all'interno che arriva sino al coperchio (3D)...mah vediamo come evolve. Confido in questi nuovi test.

[asklepios]

Se vuoi nei link alla fine della guida dell'agar c'è anche un link con diversi video su tutto il processo di coltivazione, dalle spore, agar, sterilizzazione e inoculazione di cereali. Devi avere un account su Shroomery per vederli, ma sono fatti bene.

Sulla questione della sterilità e di sterilizzare con amuchina e simili, dai un'occhiata all'ultimissimo paragrafo della guida COLTIVAZIONE - Dove iniziare.

Se vuoi un parere sulle piastre comunque posta delle foto

[Jnani]

Se vuoi nei link alla fine della guida dell'agar c'è anche un link con diversi video su tutto il processo di coltivazione, dalle spore, agar, sterilizzazione e inoculazione di cereali. Devi avere un account su Shroomery per vederli, ma sono fatti bene.

Molto interessanti i video, non li avevo ancora visti.

Sulla questione della sterilità e di sterilizzare con amuchina e simili, dai un'occhiata all'ultimissimo paragrafo della guida COLTIVAZIONE - Dove iniziare.

Se vuoi un parere sulle piastre comunque posta delle foto

Visto ma ho voluto comunque sperimentare.
Per le piastre “sopravvissute”, aspetto ancora un po’ a veder se ci son evoluzioni ma temo di no. Piuttosto attendo per un parere sul nuovo tentativo. Grazie per i consigli, devo far un po’ di esperienza poi se riuscirò, passerò alla clonazione e incroci ma ancora tanta strada davanti.

[asklepios]

Buon lavoro allora! Fa piacere vedere che qualcuno si appassiona alla coltivazione oltre i grow kit

[Jnani]

Grazie
Ieri proceduto nuovamente, vediamo nei prox gg i risultati. Migliorato tecnica e processo. Posterò qualche foto appena ci sarà uno sviluppo.

[Jnani]

@asklepios

Al secondo tentativo pare meglio. Migliorato tecnica e processo. Ne posto solo una ma anche le altre son ok. Le impronte sembrerebbero più veloci rispetto alla siringa di spore. Usato solo piastre di vetro più affidabili per la sterilizzazione.

https://imgbox.com/k1R5aU7e

[asklepios]

In basso a destra è una contaminazione, quello bianco in alto a sinistra sembrerebbe micelio

[Jnani]

Stavo attendendo che si ingrandisca un po’ perché non capisco se é così perché é partito da sotto (mi riferisco alla ipotetica contaminazione) e non in superficie come l’altro. Ad ogni modo a giorni trasferisco il micelio ok su una già fatta neutra in modo da averlo del tutto isolato. Grazie.