Contaminazione agar?

Coltivazione e conservazione di funghi e tartufi
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albert ergot
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Contaminazione agar?

Messaggio da albert ergot » mer apr 05, 2023 4:01 pm

Salve a tutti, non avendo trovato un mega-thread a riguardo, ne apro uno nuovo.

Dopo circa 3 giorni dall'inoculazione, ho notato che 3 delle 6 piastre di Petri stanno mostrando cenni di qualcosa che cresce. Sembra la stessa cosa, solo a stadi diversi, vi allego alcune foto di quella più sviluppata.

Immagine Immagine Immagine

Non ho termini di paragone concreti, essendo questo il mio tentativo, ma il puntino verdastro nel mezzo non sembra essere per niente un buon segno... Anche se, vedendo questo post su Shroomery, quello che ho qui sembra essere simile alla terza immagine sotto "Hyphal knots", lo stadio di sviluppo è completamente diverso però. :/

L'inoculazione l'ho fatta usando una siringa ammezzata che avevo fatto a partire da un'impronta e che ho usato per la PF-tek (con discreto successo). La siringa l'ho fatta diversi mesi fa ed è sempre rimasta in frigo da allora.

Cosa ne pensate?

Come sorgente di spore ho:
  • altre due impronte (di cui una fatta da me, la prima che ho fatto, quindi probabilmente non fatta esattamente a regola d'arte);
  • la siringa di cui sopra che ancora non è finita;
  • un'altra siringa mai utilizzata presa dalla stessa impronta con cui ho fatto l'altra.
Nell'eventualità, ahime probabile, che tutto vada buttato, cosa consigliate di usare per il nuovo batch?
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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da albert ergot » gio apr 06, 2023 11:36 am

Temo di potermi rispondere da solo... questa è la stessa piastra oggi, dopo un giorno dalle foto sopra.

Immagine

Direi che non ci sono dubbi, è muffa. Per quello che vale, cercando foto in giro sembra essere Penicillium o Trichoderma.

Vale la pena aspettare che esca pure il micelio e in caso trasferire quello o butto già via tutto?

Inoltre, qual è il modo giusto di sbarazzarsi di queste cose senza contaminarmi ulteriormente lo spazio di lavoro?

Io purtroppo abito in una casa dove alcune stanze hanno problemi di muffa, non quella in cui uso la SAB, ma comunque la casa è piccola. Posso senz'altro migliorare il procedimento e fare più attenzione alle operazioni, ma le spore della muffa nell'aria temo ci siano sempre. Resta tuttavia da capire se la provenienza della contaminazione è l'aria oppure la siringa, immagino ci sia da aspettare e vedere come si comportano le altre due piastre, se dovessero venire senza muffa allora credo si possa concludere che la siringa è OK.
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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da asklepios » gio apr 06, 2023 11:13 pm

C'è da capire da dove arrivi la contaminazione, se dalla siringa o da altre fonti. Ripeti l'inoculazione, ma la prossima volta lascia una piastra senza niente. Aprila come faresti con le altre, meno l'inoculazione. Se si contamina anche questa potrebbe essere un problema di tecnica e non la siringa.

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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da albert ergot » gio apr 06, 2023 11:27 pm

asklepios ha scritto:
gio apr 06, 2023 11:13 pm
C'è da capire da dove arrivi la contaminazione, se dalla siringa o da altre fonti. Ripeti l'inoculazione, ma la prossima volta lascia una piastra senza niente. Aprila come faresti con le altre, meno l'inoculazione. Se si contamina anche questa potrebbe essere un problema di tecnica e non la siringa.
È una buona idea in effetti, ci avevo pure pensato ma alla fine non l'ho fatto...

Ma con piastre in queste condizioni che suggerisci di fare, aspetto e nel caso provo a trasferire il micelio che appare (se appare) o butto via tutto il prima possibile?

In ogni caso prima o poi, trasferimento o non, mi dovrò sbarazzare di questo agar contaminato, idee su come farlo per bene? Aprire la piastra e buttarla nell'umido non sembra una buona idea. Meglio metterle in pentola a pressione prima di farlo? Vorrei salvare le piastre stesse.
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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da asklepios » ven apr 07, 2023 12:02 am

Butta via, ormai stanno già sporulando. Io in genere butto nell'umido aiutandomi con uno stuzzicadenti per rimuovere l'agar dalla piastra, quindi lavo con acqua calda e sapone per piatti (ho una spazzola che uso solo per quello). Lascio asciugare, quindi sono pronte per essere sterilizzate nuovamente. Se l'idea di avere una muffa che cresce nell'organico ti mette a disagio, puoi buttare l'agar nel water, versare della candeggina, lasciare agire per una mezz'oretta quindi tirare lo sciacquone. Non necessario, ma sicuramente efficace. Non contenendo antibiotici o altre sostanze particolari, stai buttando delle patate ammuffite essenzialmente.

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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da albert ergot » ven apr 07, 2023 1:31 pm

Okay! Piccolo aggiornamento, ad oggi (dopo circa 5 giorni) 5 piastre su 6 mostrano segni inequivocabili della stessa muffa, quella che ne ha meno ha solo una singola macchia; ma butterò tutto via come suggerito. Una piastra invece non mostra assolutamente nulla, questo mi fa pensare che magari la siringa è OK, quest'ultima la terrò per vedere che succede.
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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da albert ergot » lun apr 17, 2023 5:20 pm

L'unica piastra di quella mandata a non esser stata contaminata da quella muffa, adesso dopo circa due settimane, è così:

Immagine

Cosa ne pensate? Si tratta di micelio o qualche altra contaminazione? Essendo la prima volta non saprei come identificarlo. La foto non si vede benissimo, bianco è bianco, solo che sembra un po' lanoso... non so se è normale.
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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da asklepios » lun apr 17, 2023 10:02 pm

Potrebbe essere micelio, difficile da dire dalla foto (un altro motivo per cui non amo avvolgere le piastre interamente con la pellicola). Fai un transfer, quindi manda una foto della piastra aperta dopo il transfer. Dovresti anche sentire dall'odore. Sembra di vedere degli aloni al di fuori del bianco tipici di contaminazione batteriche, quindi un transfer è sicuramente necessario

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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da albert ergot » lun apr 17, 2023 10:47 pm

asklepios ha scritto:
lun apr 17, 2023 10:02 pm
Potrebbe essere micelio, difficile da dire dalla foto (un altro motivo per cui non amo avvolgere le piastre interamente con la pellicola). Fai un transfer, quindi manda una foto della piastra aperta dopo il transfer. Dovresti anche sentire dall'odore.
Lo farò! Ma già ora o è meglio aspettare che si estenda un altro po'?
Sembra di vedere degli aloni al di fuori del bianco tipici di contaminazione batteriche, quindi un transfer è sicuramente necessario
Quindi dici di trasferire solo la parte centrale? Non so bene come si faccia in questi casi.
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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da asklepios » mar apr 18, 2023 1:13 pm

Se effettivamente fuori dal bianco è cresciuto qualcosa, sì. Te ne accorgi perché se è cresciuto qualcosa l'agar non è trasparente come quando l'hai appena versato, ma viene coperto da una specie di "melma", non so come meglio descriverla. Sicuramente comunque te ne accorgi se c'è. Se è presente, trasferisci un pezzo di bianco un po' lontano dal bordo, altrimenti prendi un pezzetto proprio sul bordo. Lo scopo è di non trasferire i contaminanti.

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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da mirkodls » mer apr 19, 2023 12:35 am

albert ergot ha scritto:
lun apr 17, 2023 5:20 pm
L'unica piastra di quella mandata a non esser stata contaminata da quella muffa, adesso dopo circa due settimane, è così:

Immagine

Cosa ne pensate? Si tratta di micelio o qualche altra contaminazione? Essendo la prima volta non saprei come identificarlo. La foto non si vede benissimo, bianco è bianco, solo che sembra un po' lanoso... non so se è normale.
i danni con la pala :lol: non demordere! comunque non aprire le piastre assolutamente butta tutto visto ke sono in vetro se vuoi proprio tenerle vai a 10 km da casa candeggina mascherina fpp3 e pulisci tutto benissimo poi le sciaqui le metti nei sacchetti il polietilene e li sterilizzi a cannone 0,17 mpa per almeno 30 min (il metodo risolutivo) poi butta le siringhe ke hai fatto e non le fare piu usa le impronte sporali su carta argentata molto piu sicure. le piastre prendi usa e getta perche ogni volta è un casino il vetro usalo sulle selezioni dei fenotipi con gia micelio pulito.
ti dico in breve il metodo ke uso.

fungo maturo su carta stagnola con bicchiere sopra 12h metto davanti la cappa levo il bicchiere faccio asciugare e piego la carta stagnola per chiuderle poi le metto nei sacchetti di ikea quelli ke si chiudono conservazione tipo infinita.

dato ke non sono mai pulite al 100% tutte devi pulire il micelio. apri la stagnola bisturi prelevi le spore e le metti al centro della piastra e butti tutto o sterilizzi per bene il bisturi con fiamma ad alcool.

incubazione 20 24 gradi se vai troppo alto rischi di favorire i termofili quindi meglio freddo ke caldo appena germinano le spore 5 7 giorni a secondo del tipo di fungo i copelandia pure dopo 50 giorni, qui appena hai modo di fare un trasferimento fallo.
il trasferimento lo devi fare senza prendere le spore ke vedi nere e ovviamente senza contaminanti visibili.

se sei stato pulito da qui vai di selezione senno ripeti il passaggio per pulirlo una volta pulito fai colonizzare tutta la piastra e seleziona le porzioni per isolare la genetica, sui cube fa poco sui copelandia un macello se scuoti i barattoli con miceli polimorfici non compatibili muoiono un macello.

consiglio usa il parafilm per le piastre o le lasci aperte sempre nei sacchetti ikea che si chiudono.

con la cappa laminare è easy proprio senza devi stare super attento a non respirare sopra a non passare sopra le piastre a non muovere aria ecc
comunque io quando sono partito avevo fatto una farm di tricoderma :lol: :lol:

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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da albert ergot » ven apr 28, 2023 11:15 am

asklepios ha scritto:
mar apr 18, 2023 1:13 pm
Se effettivamente fuori dal bianco è cresciuto qualcosa, sì. Te ne accorgi perché se è cresciuto qualcosa l'agar non è trasparente come quando l'hai appena versato, ma viene coperto da una specie di "melma", non so come meglio descriverla. Sicuramente comunque te ne accorgi se c'è. Se è presente, trasferisci un pezzo di bianco un po' lontano dal bordo, altrimenti prendi un pezzetto proprio sul bordo. Lo scopo è di non trasferire i contaminanti.
Seguendo il tuo consiglio da quella piastra ho effettuato 6 trasferimenti che ad oggi, dopo 9 giorni, sono tutti più o meno come la seguente foto:

Immagine

Ai miei occhi inesperti sembra ragionevole, l'unico dubbio che ho è che mi sembra sempre un po' peloso, non so se è normale. L'odore della piastra di partenza era abbastanza neutro, solo un lievissimo odore di funghi.

Cosa ne pensate?
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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da asklepios » sab apr 29, 2023 12:04 am

Non è il tipico micelio "rizomatoso" che si vede in molte foto, ma personalmente ho avuto tante piastre così che hanno poi fruttificato senza problemi. A vederlo sembra essere micelio. L'odore com'è? A volte può aiutare "danneggiare" un po' con un dito, un po' come quando sfreghi tra le mani le foglie di una pianta odorosa, per sentire l'odore. In ogni caso a questo punto procederei con l'inoculazione del substrato.

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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da albert ergot » sab apr 29, 2023 6:37 am

asklepios ha scritto:
sab apr 29, 2023 12:04 am
Non è il tipico micelio "rizomatoso" che si vede in molte foto, ma personalmente ho avuto tante piastre così che hanno poi fruttificato senza problemi. A vederlo sembra essere micelio.
Grazie per la conferma!

Hai idea di quale possa essere il motivo? Tipo agar troppo morbido/duro. Per queste piastre ho usato la ricetta presente nella wiki (versione con 2.5g agar agar), l'unica cosa è che non ho riaggiunto l'acqua dopo l'evaporazione. Questo perché quando provai a farlo la prima volta, mi venne un agar decisamente troppo liquido che non sembrava rapprendersi.
L'odore com'è? A volte può aiutare "danneggiare" un po' con un dito, un po' come quando sfreghi tra le mani le foglie di una pianta odorosa, per sentire l'odore. In ogni caso a questo punto procederei con l'inoculazione del substrato.
OK, proverò con un pezzo che non uso per inoculare per non rischiare di contaminare il barattolo.
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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da albert ergot » dom apr 30, 2023 1:28 pm

albert ergot ha scritto:
sab apr 29, 2023 6:37 am
asklepios ha scritto:
sab apr 29, 2023 12:04 am
Non è il tipico micelio "rizomatoso" che si vede in molte foto, ma personalmente ho avuto tante piastre così che hanno poi fruttificato senza problemi. A vederlo sembra essere micelio.
Grazie per la conferma!

Hai idea di quale possa essere il motivo?
A quanto pare è una cosa ben nota, leggendo in giro, il micelio di questo tipo viene chiamato tomentoso a differenza dell'altro con filamenti, chiamato invece rizomorfo. Tanto per cambiare c'è un sacco di confusione e pareri discordanti riguardo al perché certe volte si sviluppi uno invece dell'altro e quale sia meglio in termini di resa...
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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da asklepios » gio mag 04, 2023 8:22 pm

Sì anch'io ho letto abbondantemente al riguardo. A leggere sembra che il micelio tomentoso non darà mai buoni risultati e che è da eliminare, altri dicono che non c'entra niente. Io ho due teorie al riguardo: il tipo di agar e il tipo di piastre Petri. La maggior parte su Shroomery utilizza MEA (malt extract agar), o addirittura l'acqua che resta dalla preparazione dei cereali. Io ho sempre utilizzato PDA, quello che descrivo nelle guide, e i miei risultati sono stati bene o male uniformemente simili. Micelio principalmente tomentoso, anche con spore da fonti diverse e clonaggio.
L'altra teoria che mi viene in mente è il tipo di piastre agar. Le piastre in plastica monouso esistono anche con dei "piedini" che distanziano il coperchio dalla base, lasciando passare un minimo d'aria. Nelle piastre in vetro invece il coperchio è perfettamente aderente, e in più le sigilliamo ulteriormente con la pellicola. In questo modo non c'è alcun ricambio d'aria con l'esterno.
In ogni caso, una volta riscontrato che il micelio è in grado di fruttificare in quantità, l'aspetto su agar diventa più una curiosità che una preoccupazione.

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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da albert ergot » lun mag 08, 2023 12:11 pm

albert ergot ha scritto:
sab apr 29, 2023 6:37 am
asklepios ha scritto:
sab apr 29, 2023 12:04 am
L'odore com'è? A volte può aiutare "danneggiare" un po' con un dito, un po' come quando sfreghi tra le mani le foglie di una pianta odorosa, per sentire l'odore. In ogni caso a questo punto procederei con l'inoculazione del substrato.
OK, proverò con un pezzo che non uso per inoculare per non rischiare di contaminare il barattolo.
L'odore era buono credo, sapeva abbastanza di funghi, e per niente sgradevole, anzi.

Allora, una settimana fa da quelle piastre ho inoculato 6 barattoli con il miglio, ammollato una notte e sterilizzato in pentola a pressione per 2 ore. Le piastre non erano completamente colonizzate quindi ho deciso di fare 1 piastra – 1 barattolo: ho preso un bel pezzo di agar colonizzato e l'ho trasferito nel barattolo, precedentemente preparato con filtro di polyfill come suggerito.

Sto notando però che la colonizzazione sembra essere estremamente lenta, inoltre in solo un barattolo il micelio sembra essere passato dall'agar al miglio:

Immagine

In tutti gli altri 5, più o meno, il risultato è il seguente (la macchia bianca in basso a destra è il riflesso della lampada):

Immagine

In un caso poi sembra quasi preferire il vetro al miglio...

I pezzi di agar sembrano essere completamente colonizzati e in buona salute.

È normale un comportamento del genere? Può essere stato un errore mio?

Ho preso quelle buste di miglio in un negozio di animali, non dovrebbe essere stato processato in alcun modo. Forse è solo questione di tempo, li sto lasciando a temperatura ambiente di circa 22 °C. Potrei incubare all'occorrenza, come feci per la PF-tek, ma speravo di evitarlo...

(L'errore palese che sicuramente ho fatto è stato quello di riempire troppo i barattoli, immagino sarà poi un problema quando verrà il tempo di scuoterli per ridistribuire il micelio, ma non dovrebbe influenzare questa prima fase.)
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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da asklepios » mar mag 09, 2023 1:38 pm

Strano per il secondo barattolo, il primo sembra in ottima salute. Non è che l'agar si sia attaccato al coperchio?

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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da albert ergot » mar mag 09, 2023 1:51 pm

asklepios ha scritto:
mar mag 09, 2023 1:38 pm
Strano per il secondo barattolo, il primo sembra in ottima salute. Non è che l'agar si sia attaccato al coperchio?
No, tra l'altro ho provato anche a scuotere un po' per cercare di aumentare la superficie di contatto tra agar e miglio. Comunque 5 su 6 sono come la seconda foto.

Vorrei iniziare un nuovo batch tra poco, usando la giusta quantità di miglio, ma mi piacerebbe capire prima se sto sbagliando qualcosa o no, per non ritrovarmi in questa situazione di nuovo.

Da inoculazione a barattolo completamente colonizzato, quanto passa mediamente con le temperature attuali (circa 22 °C)?
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Re: Contaminazione agar?

Messaggio da asklepios » mar mag 09, 2023 11:05 pm

Su quanto possa volerci non saprei dirti con esattezza, almeno un paio di settimane comunque. Se hai la possibilità prova ad incubarne un paio, magari è la temperatura il problema. Più che altro dalla foto non si capisce dove sia il pezzo di agar. Vedo tanti filamenti, ma da dove partono? L'agar è sotto? Aspettiamo a vedere in ogni caso. Se davvero non stesse colonizzando penserei problema di idratazione o di contaminazione, ma entrambi i casi mi sembrano improbabili dopo due ore di pentola a pressione

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