Contaminazione agar?

[albert ergot]

Dopo tutte queste prove mi sentirei di dire che la contaminazione viene dall'impronta che ho. I trasferimenti che ho fatto per cercare di ottenere il micelio pulito non sono serviti, l'ultima prova la sto facendo con delle piastre di water agar (agar senza altri nutrimenti) come mi è stato suggerito su Shroomery, sto ancora aspettando di vedere la differenza.

Ho acquistato una nuova siringa, oggi proverò con quella, a parità di tutto il resto, vediamo cosa succede...

[asklepios]

L'idea delle piastre ad acqua penso sia per i batteri più che altro, ma non ci sono batteri nelle tue piastre, la crescita batterica è abbastanza ovvia quando si manifesta ed è spesso accompagnata dalla produzione di metaboliti secondari. Secondo quanto dice quello su Shroomery non ci sarebbe nessuna muffa nelle tue monotub e solo contaminazione batterica. Non sono del tutto sicuro in quanto dalle foto che hai messo qua sembra chiaramente di vedere un velo che ricopre la base dei funghi, ben diverso dai "fuzzy feet" dovuti alla mancanza di ossigeno. Si vede particolarmente zoomando sull'ultima foto, ma in effetti a uno sguardo rapido potrebbe sfuggire. Non sono sicuro di vedere questa muffa nelle tue piastre, io ho avuto piastre come quelle che tu definisci muffa che hanno fruttificato senza problemi. Io piastre rizomatose come quelle che tutti hanno su Shroomery non le ho mai viste personalmente, anche con diverse spore prese da scambi fatti sul proprio sul marketplace di Shroomery. La conclusione a cui sono arrivato è che sia da imputare a qualcosa nella combinazione di piastre in vetro e ricetta dell'agar. In ogni caso non avendomi mai dato problemi di fruttificazione non mi sono mai preoccupato.

Se vuoi ripartire dalle spore bene, ma quello che farei io è prendere il fungo più in salute, pulirne bene l'esterno quindi procedere a clonarlo su agar. In questo modo sei certo che quello che cloni sulla piastra è pulito. In questo modo elimini senza ogni dubbio il fattore di inoculante contaminato, dato che comunque pur avendo adesso la piastra un aspetto passabile il dubbio un po' rimane. Se a quel punto dopo aver clonato hai ancora problemi di contaminazione sai per certo che non arriva dall'inoculante ma da qualche altro step del processo.

[asklepios]

L'idea delle piastre ad acqua penso sia per i batteri più che altro, ma non ci sono batteri nelle tue piastre, la crescita batterica è abbastanza ovvia quando si manifesta ed è spesso accompagnata dalla produzione di metaboliti secondari. Secondo quanto dice quello su Shroomery non ci sarebbe nessuna muffa nelle tue monotub e solo contaminazione batterica. Non sono del tutto sicuro in quanto dalle foto che hai messo qua sembra chiaramente di vedere un velo che ricopre la base dei funghi, ben diverso dai "fuzzy feet" dovuti alla mancanza di ossigeno. Non sono sicuro di vedere questa muffa nelle tue piastre, io ho avuto piastre come quelle che tu definisci muffa che hanno fruttificato senza problemi. Io piastre rizomatose come quelle che tutti hanno su Shroomery non le ho mai viste personalmente, anche con diverse spore prese da scambi fatti sul proprio sul marketplace di Shroomery. La conclusione a cui sono arrivato è che sia da imputare a qualcosa nella combinazione di piastre in vetro e ricetta dell'agar. In ogni caso non avendomi mai dato problemi di fruttificazione non mi sono mai preoccupato.

Se vuoi ripartire dalle spore bene, ma quello che farei io è prendere il fungo più in salute (come quello grande che si vede nella seconda foto), pulirne bene l'esterno quindi procedere a clonarlo su agar. In questo modo sei certo che quello che cresce sulla piastra è pulito. Elimini così il dubbio che l'inoculante sia contaminato, dato che comunque pur avendo adesso la piastra un aspetto passabile il dubbio un po' rimane. Se a quel punto dopo aver clonato hai ancora problemi di contaminazione sai per certo che non arriva dall'inoculante ma da qualche altro step del processo.

[Nerex]

Non ho letto esattamente tutto il thread, ma dico la mia in merito a quella parte che lessi:

- E' dato per scontato che siringhe, impronte e swab di spore siano contaminate: lo sono intrinsecamente. L'agar serve proprio per ripulire il micelio dai contaminanti, e il successo di questo procedimento dipende dalla propria tecnica e da come si effettuano i transfer. Uno dovrebbe arrivare al punto dove, senza dubbi, si hanno per mano piastre di micelio pulite; una volta che le si hanno, è buona norma fare un ulteriore transfer (di backup) appena prima di inoculare i grani. Just in case.
Inutile quindi, secondo me, prendere un'altra siringa o un'altra impronta dello stesso strain per riprovarci.
Buona idea l'uso del water agar per ripulire le colture più contaminate.

- Nel caso si fosse sufficientemente certi che le piastre usate per inoculare fossero pulite, io mi concentrerei sulla tecnica di inoculazione in SAB e sul coperchio del barattolo. Il buco è uno? Quant'è grande? Ma soprattutto: s'è stato usato il polifil, sicuri che sia abbastanza "stretto"? Io la prova che faccio è di tirarlo finché il buco si riempie abbastanza da veder il metallo sformarsi per la forza del tiro (dopo che il polifil ha smesso di scorrere). Così son sicuro che riempia bene l'orifizio del coperchio.
Ancora: SE l'agar era pulito, SE il coperchio era OK, SE i grani sono stati sterilizzati bene, il contaminante non può che esser entrato nel momento in cui hai levato il coperchio per inserire l'agar nel barattolo. Magari hai messo le mani sopra l'apertura del barattolo, magari non hai sanificato bene il barattolo, il bisturi, ecc. Magari hai toccato l'argar con una delle parti esterne del barattolo, magari hai appoggiato il coperchio sul piano della SAB, magari devi rivedere la tua tecnica insomma.

- In merito alla quantità di miglio è facile: basta seguire una qualche tek di shroomery. Ti consiglio di seguire le "no soak no simmer", per facilitarti la vita. Tipo: metti dai 230 ai 300 grammi di miglio, metti l'esatta metà di acqua e sterilizzi. Usa sempre il peso, non il volume. E' tutto ciò di cui hai bisogno.

[albert ergot]

Inutile quindi, secondo me, prendere un'altra siringa o un'altra impronta dello stesso strain per riprovarci.

Ciao e grazie per il tuo contributo. La contaminazione con cui ho a che fare a quanto pare è molto difficile da ripulire, almeno per le mie capacità, in quanto sembra crescere sopra il micelio, qualunque cosa voglia dire (vediti le foto che ho postato). Perché quindi dovrebbe essere inutile? Sporca OK, ma magari sporca in modo che micelio e contaminazione siano facilmente distinguibili.

L'una fortuna che (forse) sto avendo è con i cloni, vedi prossimo post...

[albert ergot]

Se vuoi ripartire dalle spore bene, ma quello che farei io è prendere il fungo più in salute (come quello grande che si vede nella seconda foto), pulirne bene l'esterno quindi procedere a clonarlo su agar. In questo modo sei certo che quello che cresce sulla piastra è pulito. Elimini così il dubbio che l'inoculante sia contaminato, dato che comunque pur avendo adesso la piastra un aspetto passabile il dubbio un po' rimane.

Allora ho provato a clonare su water agar (cosa super affascinante tra l'altro!), una piastra in particolare mostra del micelio molto promettente! Verso il centro della piastra comunque sembra ancora esserci quella muffa batuffolosa, ma forse il water agar sta facendo il suo lavoro, ecco una foto. Farò dei trasferimenti partendo da quei filamenti.



Per quanto riguarda la siringa di spore, un altro fallimento, OK l'esser sporca, ma quanto segue è qualcosa che non avevo mai visto, di cosa si tratta se non diversi esempi di contaminazione?

Se a quel punto dopo aver clonato hai ancora problemi di contaminazione sai per certo che non arriva dall'inoculante ma da qualche altro step del processo.

Non sono 100% d'accordo con questo, clonare è una cosa che è molto facile fare in modo sporco, metti che ho contaminazione all'esterno del fungo, anche con tutte le dovute attenzioni non sembra così improbabile che nel clone trasferito ci finisca del contaminante.

[asklepios]

Pessimo aspetto le piastre sotto, ricorda la muffa che viene sul pane, ottimo aspetto la piastra sopra. Lì direi proprio che non ci sono dubbi sulla natura del micelio. Probabilmente la natura rizomorfica si manifesta quando i nutrienti sono più scarsi.

Ovvio che devi fare un po' di pratica per clonare e può essere che non ti venga al primo colpo, ma per dirti c'è chi clona funghi raccolti nel bosco mezzo mangiati dagli animali. A vedere la foto che hai postato io non avrei dubbi adesso sulla natura del micelio. Se vuoi avere qualche parere in più posta su Shroomery, ma io sarei tranquillo. Fai un trasferimento piccolo da quella piastra clonata e potresti avere anche un isolato. A questo punto puoi fruttificare e se effettivamente non hai fatto errori precedentemente non dovresti vedere contaminazioni. Se poi il clone si comporta bene puoi tenerlo, altrimenti puoi raccogliere le spore e "resettare" la genetica, ma comunque avere delle colture su agar pulite. Per conservare il micelio nel frattempo mettilo se non su slant quanto meno su agar nutriente

[Nerex]

Inutile quindi, secondo me, prendere un'altra siringa o un'altra impronta dello stesso strain per riprovarci.

Ciao e grazie per il tuo contributo. La contaminazione con cui ho a che fare a quanto pare è molto difficile da ripulire, almeno per le mie capacità, in quanto sembra crescere sopra il micelio, qualunque cosa voglia dire (vediti le foto che ho postato). Perché quindi dovrebbe essere inutile? Sporca OK, ma magari sporca in modo che micelio e contaminazione siano facilmente distinguibili.

L'una fortuna che (forse) sto avendo è con i cloni, vedi prossimo post...

L'unica utilità di prender un'altra siringa di spore o impronta dello stesso "strain" è sperare che quella nuova sia più pulita e magari aver meno contaminanti, ma le spore sono sempre da considerare come intrinsecamente sporche, visto che sono a contatto con l'aria da quando il cappello si apre; soprattutto per questo si lavora con l'agar, per ripulire il micelio.

Io quello che farei è che trasferirei piccoli pezzi di agar (piccoli davvero, tipo della grandezza di un chicco di riso o meno) nelle parti dove sei sicuro sia solo micelio, ai bordi. Tipo a ore 8, a ore 7, ore 5 della piastra che hai mostrato nella prima foto, quella con la crescita rizomorfa. Insomma fai tanti transfer di sezioni piccolissime del micelio più lontano dal contaminante.
Poi continua così e vedi come si evolvono le prossime piastre. Nel caso specifico, credo che sia chiaro tu debba affinare la tecnica in SAB per lavorare in modo più "sterile" possibile.

In merito alla clonazione: ovviamente non è che sia una cosa sicura, ma la parte da clonare non la prendi dalla parte esterna del fungo (ch'è anch'essa intrinsecamente sporca essendo a contatto con l'aria): apri il fungo a metà, dentro la SAB, e con un bisturi sterilizzato (fiamma) prendi piccolissime parti interne del fungo, magari prendine più di una da metter su diverse piastre. Se no ne prendi una (o comunque poche) e continui il lavoro di trasferimenti in altre piastre, se dovessero esserci contaminanti.

[albert ergot]

Fai un trasferimento piccolo da quella piastra clonata e potresti avere anche un isolato.

Cosa intendi per "anche un isolato"?

Per conservare il micelio nel frattempo mettilo se non su slant quanto meno su agar nutriente

Cosa è uno slant? (Non è una domanda lazy, sto cercando e studiando in giro, ma credo che faccia bene al thread e al forum spendere qualche parola in più, non sembra ci siano molti risultati.)

E altra domanda, perché è meglio conservare a lungo termine su agar nutriente invece che no?

[albert ergot]

Ecco i primi frutti di quella monotub, sono visibilmente strani e piccoli, ma volevo spostare l'attenzione sulla parte batuffolosa che avvolge buona parte del gambo, non sembra proprio normale (specialmente foto 3 e 4). Cosa ne pensate?



Chiaramente qui ci sono dei problemi di contaminazione, e se il raccolto rimane così magro posso anche far prima a buttare tutto, ma credete che siano commestibili in queste condizioni?

Domanda un po' offtopic, va bene che questa monotub ha tutti i problemi finora descritti, ma perché i pochi funghi che stanno crescendo sembrano prediligere i bordi? L'unica cosa diversa sono condizioni di ricambio aria e umidità immagino, ma non mi è ben chiaro se qui ho bisogno di più/meno umidità/aria. Il design è quello standard: scatola da 45 litri con 6 fori, con i fori superiori aperti e quelli inferiori parzialmente otturati da micropore. Vorrei capire come ragionare per le successive monotub.

[asklepios]

Cosa intendi per "anche un isolato"?

Da quel che ho capito leggendo su Shroomery (sarebbe tutto da verificare da fonti appropriate), anche un singolo fungo è un cocktail di diversi genotipi. Anche clonando viene conservata una certa varietà di genotipi. Su agar facendo trasferimenti successivi è possibile creare quello che chiamano "isolato", che dovrebbe essere un unico genotipo, e si riconosce in quanto su agar forma un cerchio perfetto senza parti che crescono più velocemente di altre. Il vantaggio è che se trovi un isolato con buone proprietà (produttività, velocità di fruttificazione, grandezza dei frutti etc. etc.) avrai un raccolto sempre consistente. Molte delle foto che si vedono su Shroomery di tub coperte a tappeto di funghi tutti uguali sospetto siano isolati. È un lavoro che richiede un sacco di tempo (e fortuna) per ottenere buoni risultati, in quanto l'unico modo per sapere se un isolato ha buone proprietà è farlo fruttificare. Nei link utili della guida sull'agar in wiki trovi un paio di thread di Shroomery al riguardo.

Cosa è uno slant? (Non è una domanda lazy, sto cercando e studiando in giro, ma credo che faccia bene al thread e al forum spendere qualche parola in più, non sembra ci siano molti risultati.)

Uno slant è una provetta contenente agar e un pezzetto di legno. È un modo per conservare il micelio in frigorifero per periodi di tempo lunghi. Il legno in teoria fornisce dei nutrienti a lento rilascio. Secondo quanto si dice su Shroomery, così micelio può durare anche un paio d'anni

E altra domanda, perché è meglio conservare a lungo termine su agar nutriente invece che no?

Beh come ogni essere vivente il micelio ha bisogno di nutrimento, altrimenti dopo un po' muore

Sulla tub non saprei dirti sinceramente. Le condizioni superficiali sembrano buone. Magari è troppo umido il centro? Non saprei. Magari è la contaminazione

[albert ergot]

Continuo questo thread che è diventato un po' un piccolo journal, e mi sembra giusto aggiornarlo anche per risultati positivi e non solo disastri. Volevo condividere con voi il primo flush dell'ultima monotub:



Ho raccolto quasi tutto, ho tenuto qualche fungo ancora piccolo, distante degli altri per vedere se nel prossimo giorno finisce di crescere.

Nonostante solo una parte (circa metà) di substrato abbia prodotto frutti mi sento molto soddisfatto del risultato. Tra l'altro mi chiedo perché, come mai una bella fetta di monotub non ha fatto pin? Le condizioni superficiali sembravano identiche, l'unica cosa è che in alcune ore del giorno quella parte prendeva un po' più di luce solare, ma non so se giustifica. Quale potrebbe essere il motivo?

Tra poco quindi dovrò provare ad iniziare il secondo flush. Non ho ancora studiato bene questa parte. Voi come fate di solito? Avete dei consigli?